Com base no sistema de edição de genes CRISPR, os pesquisadores do MIT projetaram uma nova ferramenta que pode cortar genes defeituosos e substituí-los por novos, de maneira mais segura e eficiente.
Por Sarah McDonnell, Instituto de Tecnologia de Massachusetts com informações de Phys.
Usando esse sistema, os pesquisadores mostraram que poderiam fornecer genes de até 36.000 pares de bases de DNA para vários tipos de células humanas, bem como para células hepáticas de camundongos. A nova técnica, conhecida como PASTE, pode ser promissora no tratamento de doenças causadas por genes defeituosos com um grande número de mutações, como a fibrose cística.
“É uma nova maneira genética de atingir potencialmente essas doenças realmente difíceis de tratar”, diz Omar Abudayyeh, um McGovern Fellow do McGovern Institute for Brain Research do MIT. “Queríamos trabalhar para o que a terapia genética deveria fazer em seu início original, que é substituir genes, não apenas corrigir mutações individuais”.
A nova ferramenta combina o direcionamento preciso do CRISPR-Cas9, um conjunto de moléculas originalmente derivadas de sistemas de defesa bacterianos, com enzimas chamadas integrases, que os vírus usam para inserir seu próprio material genético em um genoma bacteriano .
“Assim como o CRISPR, essas integrases vêm da batalha contínua entre as bactérias e os vírus que as infectam”, diz Jonathan Gootenberg, também um McGovern Fellow. “Isso mostra como podemos continuar encontrando uma abundância de novas ferramentas interessantes e úteis desses sistemas naturais”.
Gootenberg e Abudayyeh são os autores seniores do novo estudo, publicado hoje na Nature Biotechnology . Os principais autores do estudo são os associados técnicos do MIT Matthew Yarnall e Rohan Krajeski, a ex-aluna de pós-graduação do MIT Eleonora Ioannidi e o aluno de pós-graduação do MIT Cian Schmitt-Ulms.
inserção de DNA
O sistema de edição de genes CRISPR-Cas9 consiste em uma enzima de corte de DNA chamada Cas9 e uma cadeia curta de RNA que guia a enzima para uma área específica do genoma, direcionando Cas9 para onde fazer seu corte. Quando Cas9 e o RNA guia são direcionados a um gene doente, são entregues nas células, um corte específico é feito no genoma, e os processos de reparo do DNA das células colam o corte, geralmente excluindo uma pequena porção do genoma.
Se um modelo de DNA também for entregue, as células podem incorporar uma cópia corrigida em seus genomas durante o processo de reparo. No entanto, esse processo requer que as células façam quebras de fita dupla em seu DNA, o que pode causar deleções ou rearranjos cromossômicos prejudiciais às células. Outra limitação é que ele só funciona em células que estão se dividindo, pois as células que não se dividem não têm processos ativos de reparo do DNA.
A equipe do MIT queria desenvolver uma ferramenta que pudesse cortar um gene defeituoso e substituí-lo por um novo sem induzir quebras de DNA de fita dupla. Para atingir esse objetivo, eles se voltaram para uma família de enzimas chamadas integrases, que vírus chamados bacteriófagos usam para se inserir nos genomas bacterianos.
Para este estudo, os pesquisadores se concentraram nas serinas integrases, que podem inserir grandes pedaços de DNA, de até 50.000 pares de bases. Essas enzimas têm como alvo sequências genômicas específicas conhecidas como sítios de ligação, que funcionam como “placas de aterrissagem”. Quando encontram a plataforma de aterrissagem correta no genoma do hospedeiro, eles se ligam a ela e integram sua carga útil de DNA.
Em trabalhos anteriores, os cientistas acharam desafiador desenvolver essas enzimas para terapia humana porque as plataformas de aterrissagem são muito específicas e é difícil reprogramar integrases para atingir outros locais. A equipe do MIT percebeu que a combinação dessas enzimas com um sistema CRISPR-Cas9 que insere o local de pouso correto permitiria uma fácil reprogramação do poderoso sistema de inserção.
A nova ferramenta, PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements), inclui uma enzima Cas9 que corta em um local genômico específico, guiada por uma cadeia de RNA que se liga a esse local. Isso permite que eles alvejem qualquer local no genoma para inserção do local de pouso, que contém 46 pares de bases de DNA. Essa inserção pode ser feita sem a introdução de quebras na fita dupla, adicionando primeiro uma fita de DNA por meio de uma transcriptase reversa fundida e, em seguida, sua fita complementar.
Uma vez que o local de pouso é incorporado, a integrase pode vir e inserir sua carga útil de DNA muito maior no genoma naquele local.
“Achamos que este é um grande passo para alcançar o sonho da inserção programável de DNA”, diz Gootenberg. “É uma técnica que pode ser facilmente adaptada tanto ao local que queremos integrar quanto à carga.”
substituição de gene
Neste estudo, os pesquisadores mostraram que poderiam usar o PASTE para inserir genes em vários tipos de células humanas, incluindo células do fígado , células T e linfoblastos (glóbulos brancos imaturos). Eles testaram o sistema de entrega com 13 genes de carga útil diferentes, incluindo alguns que poderiam ser terapeuticamente úteis, e conseguiram inseri-los em nove locais diferentes no genoma.
Nessas células, os pesquisadores conseguiram inserir genes com uma taxa de sucesso variando de 5 a 60 por cento. Essa abordagem também rendeu muito poucos “indels” indesejados (inserções ou deleções) nos locais de integração do gene.
“Vemos muito poucos indels e, como não estamos fazendo quebras de fita dupla, você não precisa se preocupar com rearranjos cromossômicos ou deleções de braços cromossômicos em larga escala”, diz Abudayyeh.
Os pesquisadores também demonstraram que poderiam inserir genes em fígados “humanizados” de camundongos. Os fígados desses camundongos consistem em cerca de 70% de hepatócitos humanos, e o PASTE integrou com sucesso novos genes em cerca de 2,5% dessas células .
As sequências de DNA que os pesquisadores inseriram neste estudo tinham até 36.000 pares de bases, mas eles acreditam que sequências ainda mais longas também poderiam ser usadas. Um gene humano pode variar de algumas centenas a mais de 2 milhões de pares de bases, embora para fins terapêuticos seja necessário usar apenas a sequência codificadora da proteína, reduzindo drasticamente o tamanho do segmento de DNA que precisa ser inserido no genoma.
Os pesquisadores agora estão explorando ainda mais a possibilidade de usar essa ferramenta como uma forma possível de substituir o gene defeituoso da fibrose cística. Essa técnica também pode ser útil para tratar doenças do sangue causadas por genes defeituosos , como hemofilia e deficiência de G6PD, ou doença de Huntington, um distúrbio neurológico causado por um gene defeituoso que possui muitas repetições de genes.
Os pesquisadores também disponibilizaram suas construções genéticas online para outros cientistas usarem.
“Uma das coisas fantásticas sobre a engenharia dessas tecnologias moleculares é que as pessoas podem construí-las, desenvolvê-las e aplicá-las de maneiras que talvez não tenhamos pensado ou considerado”, diz Gootenberg. “É muito bom fazer parte dessa comunidade emergente.”
Mais informações: Omar Abudayyeh, Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases, Nature Biotechnology (2022). DOI: 10.1038/s41587-022-01527-4. www.nature.com/articles/s41587-022-01527-4
